細(xì)胞傳代培養(yǎng)

根據(jù)細(xì)胞生長的恃點(diǎn)，細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法有3種：貼壁生長細(xì)胞傳代、半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）、懸浮生長細(xì)胞傳代。

◆ 貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；

◆ 部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打可傳代；

◆ 懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打傳代。

實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞、D-Hanks液、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 / RPMI1640培養(yǎng)基、Penicillin-Streptomycin（P/S雙抗）、胰蛋白酶

儀器與耗材：凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、玻璃瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿、廢液缸、離心管、紅血球計(jì)數(shù)板、不同規(guī)格的移液器及其配套的無菌吸頭、吸管

1.  貼壁細(xì)胞的消化法傳代：

1）先吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。

2）D-Hanks液洗2～3次。

3）向瓶內(nèi)加入適量消化液（胰蛋白酶或與EDTA混合液）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面。（注意：胰蛋白酶要預(yù)溫，溫度37℃左右為宜。）

4）消化最好在37℃環(huán)境下進(jìn)行，消化2～5 min 后把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化。

5）吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶把殘留消化液沖掉，再添加培養(yǎng)液。如僅用胰蛋白酶可直接加少許含血清的培養(yǎng)液，終止消化。

6）用彎頭吸管，吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞。從培養(yǎng)瓶底部一邊開始到另一邊結(jié)束，以確保所有底部都被吹到，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過猛。 

7） 細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

8）置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（注意：要定時(shí)觀察細(xì)胞，如發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時(shí)處理。）

2.  懸浮細(xì)胞的傳代：懸浮細(xì)胞傳代可離心收集細(xì)胞后傳代，或直接傳代。

離心傳代法：

1） 將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到15 ml 離心管內(nèi)。

2） 800~1000 rpm離心5 min。（注意：離心轉(zhuǎn)速要合適。轉(zhuǎn)速過低，不能有效分離細(xì)胞；離心速度過大，時(shí)間過長，會(huì)擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。）

3） 棄去上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打形成細(xì)胞懸液。

4） 計(jì)數(shù)，分別接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。

 直接傳代法：

讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后再傳代。

3.  部分貼壁細(xì)胞的傳代

1）部分貼壁不牢的細(xì)胞，如Hela細(xì)胞等，不經(jīng)消化處理直接吹打可使細(xì)胞從壁上脫落下來，而進(jìn)行傳代。
2）對絕大部分貼壁生長的細(xì)胞，因直接吹打?qū)?xì)胞損傷較大，細(xì)胞常有較大數(shù)量的丟失，因而需消化后，才能吹打傳代。